同源重组法在质粒构建中的应用

同源重组法质粒构建在基因功能研究、蛋白表达及纯化等生物医疗领域拥有广泛的应用。该方法涵盖基因敲除、敲低及过表达等技术，旨在探究基因功能、表达调控机制以及其对细胞生理过程和表型的影响。通过优化启动子和核糖体结合位点等表达元件，并选择合适的宿主细胞，利用同源重组法构建表达载体，使目标蛋白在宿主细胞中实现高效表达，从而达到表达和纯化目标蛋白的目的。

与传统酶切法依赖限制性内切酶特异性切割DNA不同，同源重组法质粒构建是基于DNA分子间的同源序列进行重组。以下将介绍同源重组法质粒构建的实验步骤和流程。

实验流程

材料与仪器

进行同源重组法质粒构建所需的材料包括：目的片段的cDNA、引物、载体、限制性内切酶、酶切buffer、LB培养基、含LB培养基的细菌培养皿、同源重组酶、高保真酶、感受态细胞DH5α、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、EP管、离心管、移液枪及枪头等。

实验步骤

同源重组法构建质粒的具体步骤如下：

1. 根据目的片段的酶切位点选择相应的内切酶，通过双酶切法将环状载体质粒切割成线性化载体，并用琼脂糖凝胶法回收酶切产物，具体回收方法依照试剂盒操作说明。
2. 利用PCR技术扩增目的片段的序列，并用琼脂糖凝胶法回收扩增产物。
3. 将线性化的载体与扩增的片段按比例连接，在37℃下反应30分钟或更长时间（1-2小时）。将连接后的重组质粒（10μl）转入克隆感受态细胞DH5α，轻轻吹打均匀，静置在冰上30分钟，然后在42°C水浴中热激90秒，接着立即置于冰上冷却2-3分钟。
4. 加入500μl不添加抗生素的LB液体培养基，37℃下摇菌1小时，转速250rpm。
5. 将培养液以5000rpm离心5分钟，弃去300μl上清，利用剩余培养基重悬细菌，最好按不同梯度涂布，以避免单克隆菌过密或过疏，使用无菌涂布棒在含质粒抗性的平板上均匀涂布，并在37℃培养箱中培养10-12小时。
6. 过夜后，用1μl枪头挑取单克隆菌，置于5ml的含抗生素的LB液体培养基中，继续培养10-12小时。
7. 使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，并用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
8. 同时，可以从部分菌液中提取进行菌液PCR，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，以进一步鉴定重组质粒的正确性。
9. 将鉴定成功的菌液送至测序公司进行双向测序，待序列结果比对无误后，标志着重组质粒构建成功，可以进行后续实验。

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